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Analisi dei problemi comuni nell'espressione della proteina procariotica

Tempo di aggiornamento : 2021-03-04

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Analisi dei problemi comuni nell'espressione della proteina procariotica

L'espressione procariotica si riferisce al metodo di costruzione di un vettore di espressione e di introduzione di un gene bersaglio estraneo in un ceppo di espressione attraverso la tecnologia di clonazione genica, in modo che possa essere espresso in uno specifico organismo o cellula procariota. Il sistema di espressione delle proteine procariotiche è attualmente il metodo di espressione delle proteine più comunemente usato ed economico. Il sistema di espressione di Escherichia coli è uno dei sistemi di espressione della proteina procariotica più ampiamente utilizzati.

Escherichia coli expression system Features

Un sistema di espressione completo di solito include vettori di espressione di supporto e ceppi di espressione. Se è un'espressione indotta speciale, include anche un induttore e l'espressione di fusione include anche un sistema di purificazione o rilevamento di tag. La scelta di un sistema di espressione di solito dipende dallo scopo dell'esperimento, come il livello di espressione, l'attività della proteina bersaglio, il metodo di purificazione del prodotto di espressione e così via. Quanto segue introduce i problemi comuni nel processo di espressione procariotica.

 

D: Perché la proteina bersaglio appare sempre sotto forma di corpi di inclusione?

R: Nell'espressione e nella purificazione dei procarioti, la proteina bersaglio spesso si ripiega male e si aggrega in corpi di inclusione. Dopo l'induzione, l'espressione della proteina bersaglio può solitamente raggiungere più del 50% della proteina cellulare totale.

Sebbene una certa proporzione della proteina esista in forma solubile, fino al 95% della proteina è presente nei corpi di inclusione. Per ottenere proteine più solubili, durante l'esperimento, la temperatura di induzione può essere abbassata, ad esempio, 16-30 ° C, oppure la concentrazione di IPTG (0,01-0,1 mM) può essere ridotta e il tempo di induzione può essere prolungato. Un mezzo speciale può essere utilizzato anche per coltivare i batteri.



D: Perché è difficile esprimere le proteine transmembrana?

R: Il tasso di successo relativamente basso dell'espressione della proteina transmembrana è un problema comune. Ci possono essere due ragioni principali:

 

1. Le proteine transmembrana sono generalmente costituite da forti molecole di amminoacidi idrofobici e molecole idrofile che sono collegate in modo saltellante per formare la più semplice struttura chimica transmembrana idrofila e idrofoba, che è simile alla struttura dei peptidi segnale.

Per le cellule procariotiche, gli organelli semplici possono difficilmente completare il complesso processo di riconoscimento ed escissione del peptide segnale, guidando il reticolo endoplasmatico e l'apparato del Golgi a riconfezionarsi e secernere come le cellule eucariotiche. Alcune proteine attraversano la membrana più volte. Per le cellule procariotiche È quasi impossibile per la cellula completare l'operazione.


2. Per i frammenti idrofobici, i corpi di inclusione si formano facilmente nell'espressione delle cellule procariotiche. I peptidi idrofobici possono inibire il processo di traduzione e persino fondersi con la struttura della membrana procariotica per formare tossicità. Nell'istinto di autoprotezione biologica, tutti gli organelli interromperanno il processo di sintesi proteica.

 

Se sei interessato a questo argomento, continua a seguire l'articolo aggiornato di Generalbiosystems sull'analisi dei problemi comuni nell'espressione delle proteine procariotiche.