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Tre sistemi di espressione della proteina ricombinante

Tempo di aggiornamento : 2021-02-03

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Tre sistemi di espressione della proteina ricombinante
L'espressione ricombinante della proteina si riferisce alla clonazione del gene estraneo in un vettore di espressione contenente un promotore specifico e che ne consente la sovraespressione in E. coli sotto l'induzione di IPTG. Diverse proteine sono adatte a diversi sistemi di espressione, inclusi principalmente vettori di espressione, ceppi ospiti e condizioni di induzione.

Scelta del vettore di espressione:


La scelta del vettore di espressione della proteina di fusione è limitata da molti fattori. Prima di tutto, deve esserci un sito di clonazione multiplo adatto sul vettore. In secondo luogo, è necessario selezionare il tag di fusione appropriato in base alle successive condizioni di purificazione delle proteine.


I tag fusion comunemente usati sono His.Tag, GST.Tag, Nus.Tag e Trx.Tag. Tra questi, il tag His è relativamente piccolo e non ha alcun impatto evidente sulle proprietà strutturali della proteina.

Dopo la purificazione mediante cromatografia di affinità, la rimozione del tag non è necessaria; tuttavia, un tag leggermente più grande come GST deve essere rimosso con un enzima specifico nel processo successivo. In molte applicazioni pratiche, è spesso desiderabile esprimere una proteina attiva solubile.

La solubilità di una specifica proteina bersaglio dipende da molti fattori, incluso il vettore. Il vettore con GST.Tag può aumentare la solubilità della proteina di fusione.


Selezione del ceppo ospite:


Lo stato di espressione della stessa proteina in diversi ospiti può essere diverso. Gli host della serie BL21 sono attualmente i più utilizzati. Il ceppo ospite di Rosetta derivato da BL21 può migliorare l'espressione di proteine eucariotiche con rari codoni di E. coli.

Questo ceppo integra i tRNA dei codoni AUA, AGG, AGA, CUA, CCC e GGA attraverso un plasmide resistente al cloramfenicolo compatibile. In questo modo, il ceppo Rosetta fornisce una traduzione "universale", evitando così restrizioni di espressione dovute alla frequenza di utilizzo del codone di E. coli. L'host BL21 (DE3) facilita la formazione di corpi di inclusione.


Condizioni di induzione:


Anche i cambiamenti nelle condizioni di induzione influenzano l'espressione delle proteine. In generale, le proteine solubili sono principalmente necessarie nelle applicazioni pratiche, che richiedono la ricerca della temperatura di induzione più adatta.

La proporzione di proteine solubili sintetizzate dalla maggior parte delle proteine in condizioni di induzione durante la notte a basse temperature (15 ~ 25 ℃) sarà relativamente grande.


Inoltre, la concentrazione dell'induttore ha anche un effetto sullo stato di espressione della proteina e una bassa concentrazione dell'induttore è benefica per l'espressione della proteina solubile. Una temperatura più alta può aumentare la velocità di sintesi proteica, la velocità di piegatura degli intermedi per formare aggregati e la forza di interazione idrofobica.


È probabile che la proteina espressa esista sotto forma di corpi di inclusione. La maggiore concentrazione di induttore (0,8-10 mM IPTG) può anche promuovere la formazione di corpi di inclusione nei batteri. Per i ricombinanti pET con promotori T7 ordinari, IPTG con una concentrazione finale di 0,5 mM può essere completamente indotto, mentre i vettori con promotori T7lac richiedono IPTG con una concentrazione finale di 0,8 mM per essere completamente indotto.


In alcuni batteri ospiti DE3, il livello di espressione della proteina può essere modificato regolando la concentrazione di IPTG. Generalmente, una piccola quantità di induzione del test viene eseguita prima dell'espressione su larga scala della proteina per determinare la concentrazione ottimale di IPTG e la temperatura di induzione ottimale per far raggiungere alla proteina bersaglio la migliore attività e solubilità.

Per operazioni più specifiche di induzione, vedere Generalbiosystems, l' ultimo aggiornamento dell'articolo della società di espressione della proteina ricombinante.